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CRISP-Cas Tecnología: Wir mussen wissen – Wir werden wissen (I)

Las secuencias CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) son repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas, que junto a las proteínas Cas asociadas que actúan como endonucleasas son los dos elementos que forman parte del primitivo sistema adaptativo de defensa de las células procariotas que se conserva en el genoma de las mismas, y que nuestro querido Francis Mojica ya observó en arqueas, concretamente en Haloferax mediterranei hace ya 26 años.

Mojica buscaba fragmentos del ADN que pudieran expresarse en función de la concentración de sal, y que justificaran la capacidad de supervivencia de Haloferax en este medio tan limitante. En su observación ya detectó secuencias repetidas en el genoma de esta arquea con regiones de hasta 1,4 Kb de repeticiones en tándem que inicialmente denominó TREPS (“tándem repeats”). La presencia de estas repeticiones ya había sido descrita en otros microorganismos como E. Coli (Ishino Y, 1987), M. tuberculosis (Hermans PW, 1991), no obstante, esas repeticiones solo eran una curiosidad de los genomas estudiados sin tener conocimiento de cuáles podrían ser realmente las funciones atribuidas o ni siquiera si tenían alguna función.

Como decía Saint Hilaire “delante de nosotros siempre está el infinito”. Mojica se preguntaba que función podrían tener estas repeticiones, debían ser importantes ya que eran comunes en distintos microorganismos que estaban muy separados en la línea temporal de la evolución. Esta búsqueda convirtió a Mojica en un coleccionista, no de huesos, sino de secuencias repetidas similares en otras bacterias y arqueas, y en el año 2.000 las denominó como SRSR (“short regularly spaced repeats”); prácticamente 2 años más tarde con su amigo R. Jansen publicó un artículo (Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM. Mol Microbiol. 2002 Mar;43(6):1565-75) donde identificaban 4 genes asociados a estas secuencias repetidas, decidieron ponerle nombre y la bautizaron con el beneplácito de la esposa de Mojica como CRISPR, y a los genes asociados a estas regiones CRISPR se les denominó como genes Cas. La tecnología que nos abría un futuro sin límites ya tenía nombre, y surgió aquí frente a nuestro Mare Nostrum.

Fue en 2003 cuando Mojica descubre que esas secuencias repetidas en tándem son fragmentos de genomas de virus y plásmidos invasores de las bacterias, y cuando portaban estos fragmentos, que además se podían transmitir a la descendencia, las bacterias eran resistentes a los virus (Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Soria E. J Mol Evol. 2005 Feb;60(2):174-82).

Hace 6 años, la revista Science seleccionó al sistema CRISPR como el avance científico más relevante del año, y hoy conocemos diferentes sistemas CRISPR con distintos niveles de complejidad que se emplean en laboratorios de todo el mundo como una herramienta de edición genética, que edita con elevada precisión cualquier tipo de genoma permitiendo eliminar genes, regular su expresión, añadir genes, es el “Paintbrush” de la genética molecular. 

El desarrollo de la edición genómica dirigida es una de las líneas de investigación de la biología molecular y  de la terapia génica que mayor desarrollo ha tenido en los últimos 50 años. Hemos pasado de los sistemas de reparación por recombinación homóloga (HDR) de los 70, a las nucleasas con dedos de zinc y tecnología TALENS (“transcription activator-like effector nucleases), técnicas que todavía hoy son utilizadas por su facilidad de localizar secuencias y elevada precisión al escindir, pero en ocasiones su construcción resulta complicada.

Mecanismo de acción

El sistema CRISPR se compone de dos elementos, de un lado tenemos el ARN que proviene de la secuencia CRISPR y que conocemos como ARNcr, y por otro lado la endonucleasa Cas. El primero funciona a modo de guía y se fija sobre la secuencia que queremos buscar en el genoma, y la proteína Cas realiza la escisión sobre el ADN.

El “modus operandi” es el mecanismo de defensa de bacterias y arqueas y semejante al mecanismo de ARN de interferencia que podemos encontrar en eucariotas, que identifica, fija y degrada las secuencias de nucleótidos exógenos.

Abundando más en su estructura, CRISPR tiene un promotor y un conjunto de secuencias espaciadoras que pueden ser de entre 25 y 50 nucleótidos que se encuentran flanqueados por secuencias repetidas de carácter palindrómico de una media de 32 nucleótidos.

Cuando una bacteria es expuesta a un patógeno o un plásmido, adquiere la secuencia espaciadora, la célula reconoce una parte de esa secuencia denominada PAM (motivo adyacente al protoespaciador) e incorpora los nucleótidos adyacentes al PAM como una nueva secuencia espaciadora, duplicando la secuencia repetida que flanquea la nueva secuencia espaciadora por ambos lados.

Posteriormente, a partir de la secuencia espaciadora se transcribe el ARNcr y se unirá al sistema Cas que presenta una elevada variabilidad dependiendo de la endonucleasa involucrada, según sea Cas3, Cas9 y Cas6, conocidos como sistemas CRISPR I, II y III.

En caso de una reinfección de la bacteria,  la porción de la secuencia espaciadora del ARNcr maduro reconoce y forma un complejo ADN-ARN con el material exógeno y este complejo es reconocido por los dos dominios de corte dela enzima Cas: RuvC y HNH, que cortan una hebra distinta, por lo cual el proceso se conoce como double strand break (DSB).




The revolution in genetic engineering: CRISPR/Cas system. María Fernanda Lammoglia-Cobo,*

Emilio María Dolores Pedrero
Doctor en Veterinaria
Académico numerario de la ACVRM

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